کریسپر چیست؟

کریسپر چیست؟ به زبان ساده

کریسپر نوعی تکنولوژی جدید ویرایش ژنتیکی است که می‌تواند به پیشرفت ژن درمانی کمک‌های زیادی بکند. تاکنون ژن درمانی عمدتا از طریق تکنیک «انتقال ژن» (gene transfer) انجام شده است؛ به این صورت که یک ویروس بی‌گزند، نسخه‌ی سالمی از یک ژن را به سلول منتقل می‌کند تا جای ژن معیوب را که بیماری ایجاد کرده، بگیرد. اما در روش کریسپر، دانشمندان می‌توانند مستقیما ژن معیوب را اصلاح کنند. آنها DNA معیوب را جدا کرده و به جای آن یک DNA سالم می‌گذارند و یا اینکه با ایجاد جهش های حذفی یک ژن معیوب را از کار می اندازند. قاعدتا، این روش باید خیلی بهتر از اضافه کردن یک ژن جدید جواب دهد، چون در این صورت خطرات ناشی از اضافه کردن یک ژن غریبه و خارجی از میان می‌رود. گاهی اوقات ممکن است این ژن خارجی در مکان اشتباهی قرار گیرد و منجر به سرطان شود اما ژنی که با تکنیک کریسپر ترمیم شده تحت کنترل خواهد بود.

منشأ وجود کریسپر

منشأ این فناوری در اصل سیستم دفاعی و ایمنی اکتسابی پروکاریوتی در باکتری‌ها و آرکی باکتری ها بر علیه باکتریوفاژ می‌باشد. در باکتری این سازوکار دفاعی، از طریق DNA ضبط شده از ویروس‌هایی که قبلاً به باکتری یا اجداد آن حمله کرده بودند و توالی ویروس‌ها در ژنوم باکتری ثبت شده، صورت می‌گیرد. زمانی که دوباره ویروس به باکتری حمله کند، DNA ویروس توسط باکتری شناسایی شده و مولکول RNA راهنما با توالی مشخص ویروسی رونویسی شده سپس با پروتئینی به نام Cas9 کمپلکسی ایجاد می‌شود که به ژنوم ویروس مهاجم حمله می‌کند و توالی مکمل RNA به توالی ویروس چسبیده و پروتئین CAS9 این قطعه را برش می‌دهد و قطعه قطعه میکند و ویروس متلاشی می‌شود.

مکانیسم عمل کریسپر

سیستم crispr/cas شامل دو مولکول کلیدی برای ایجاد تغییر یا جهش در DNA می باشد.که عبارت اند از :

• یک آنزیم به نام cas، این آنزیم به عنوان یک جفت قیچی مولکولی عمل می کند که می تواند دو رشته DNA را در محل خاصی از ژنوم برش دهد که آن قسمت کوچک DNA می تواند بعدا در طی مسیر های ترمیم سلول اضافه یا حذف شود.
• قطعه ای از RNA، که به آن RNA راهنما (gRNA) گفته می شود. این قطعه شامل توالی ریبونوکلئیک اسید از پیش طراحی شده است که طول آن حدود ۲۰ نوکلئوتید می باشد.

ابتدا Cas9باید یک توالی کوتاه در ژن هدف با نام PAM را شناسایی کرده و به آن متصل شود اگر PAM وجود نداشته باشد یا DNA مجاور به طور کامل با RNA راهنما مطابقت نداشته باشد، Cas9 حرکت می کند و در جای دیگری جستجو می کند. به‌محض اتصال gRNA، ساختار مارپیچ دوتایی DNA را از هم باز می‌کند. زمانی که RNA دنباله صحیح را پیدا کند، Cas9 آن بخش از DNA را برش می‌دهد، به‌شرط آن که توالی فاصله دهنده RNA، همسانی کافی با DNA هدف داشته باشد.

نتیجه نهایی برش DNA توسط Cas9 یک شکست دو رشته‌ای (DSB)است که توسط دو مسیر تعمیر می‌شودکه به شرح زیر است:

1. مسیر اتصال انتهایی غیر همولوگ اما مستعد خطا (NHEJ) در صورت عدم وجود توالی همولوگ این مسیر فعال میشود.
2. مسیر تعمیر هدایت‌شده همولوگ بادقت بالاتر (HDR) این مسیر با وجود رشته همولوگ یا کروماتید خواهری فعال میشود.

با فعال شدن یکی از مسیر های ترمیمی این برش ایجاد شده در DNA تعمیر میشود، اما فرایند تعمیری همراه با خطا خواهد بود و اغلب دارای جهش‌های ناخواسته می‌باشد که موجب بلااستفاده شدن ژن می‌گردد و این موضوع باعث می‌شود که CRISPR یک ابزار عالی برای غیرفعال‌کردن ژن‌های به‌خصوص باشد اما قیچی کردن رشته دوتایی تنها کاری نیست که CRISPR می‌تواند انجام دهد.  برخی از محققان بخش های برش Cas9 را غیرفعال کرده‌اند و آنزیم‌های جدید را به درون این پروتئین وارد ساختند آنگاه از Cas9 می‌توان برای منتقل کردن آن آنزیم‌ها به یک دنباله بخصوص از DNA استفاده کرد.

انواع مختلف Cas 9

تا به امروز، سه نوع مختلف از نوکلئاز Cas9 در پروتکل‌های ویرایش ژنوم، مورداستفاده قرار گرفته است:

۱-  نوع طبیعی Cas 9

نوع طبیعی Cas9 (Wild-type Cas9 nuclease) که می‌تواند به طور اختصاصی DNA را به‌صورت دو رشته‌ای برش بزند و در نتیجه منجر به فعال‌سازی ماشین‌های ترمیم دورشته‌ای (DSBs) داخل سلولی شود. در صورت عدم وجود الگوی ترمیم همولوگ، ترمیم از مسیر اتصال انتهای غیرهمولوگ (NHEJ) پیش می‌رود و در نتیجه‌ی ورود و یا حذف بازها (Indels) در محل موردنظر، منجر به اختلال در توالی هدف می‌شود. از طرف دیگر، با فراهم‌کردن یک الگوی ترمیم همولوگ و بهره‌مندی از مسیر ترمیم هومولوگی (HDR)، می‌توان جهش‌های دقیقی را در محل موردنظر، از طریق خارج کردن (Knock-out) و یا واردکردن (knock-in) یک توالی خاص انجام داد.

۲- نوع جهش‌یافته‌ی Cas 9

فرم جهش‌یافته‌ی Cas9 (Mutated Cas9  یا  nickase Cas9:nCas9) که می‌تواند یک شکاف تک‌رشته‌ای (Single-strand nick) در محل موردنظر ایجاد کند؛ بنابراین مسیر ترمیم NHEJ فعال نشده و احتمال جهش‌های Indel کاهش می‌یابد. به‌منظور برش دورشته‌ای و ترمیم HDR، باید با طراحی دو sgRNA ،دو شکاف مجاور در محل موردنظر ایجاد کرد.

۳- نوع بدون فعالیت نوکلئازی Cas 9

فرم Cas9 بدون فعالیت نوکلئازی (Nuclease-deficient Cas9: dCas9) که با موتاسیون در دومین‌های نوکلئازی آن قادر به برش DNA نیست، اما هنوز می‌تواند با هدایت sgRNA به محل موردنظر متصل شود؛ بنابراین دومین‌های عمل‌کننده‌ی مختلف (فعال‌کننده‌های رونویسی، سرکوب‌کننده‌ها و پروتئین‌های فلورسنت) را می‌توان با اتصال به dCas9 به محل موردنظر هدایت کرد.

کاربردهای فناوری CRISPR

با CRISPR، اختلال هدفمند هر ژن – در بیشتر موجودات – امکان پذیر است. این به دانشمندان اجازه می دهد تا DNA ژنومی را با دقت اصلاح کنند تا اطمینان حاصل شود که هیچ ژن یا توالی دیگری به طور ناخواسته مختل نمی شود. فناوری CRISPR آسان‌تر، سریع‌تر و کم‌هزینه‌تر از سایر تکنیک‌های ویرایش ژن است و می‌توان از آن برای ویرایش چندین ژن به طور همزمان در یک سلول استفاده کرد. در نهایت، CRISPR نیاز به معرفی تنها یک پروتئین (Cas9) و یک sgRNA به یک سلول دارد. می توان انتظار داشت که چنین فناوری قدرتمندی طیف وسیعی از کاربردها را داشته باشد. در حال حاضر این فناوری به طور گسترده در مهندسی زیستی استفاده می شود، از بیان ساده فنوتیپ تا پیشرفته ترین هدف گیری سرطان در ژنوم انسان.

کاربرد کریسپر در علوم زیستی

CRISPR را می توان در زمینه انرژی های تجدیدپذیر و کشاورزی نیز استفاده کرد. CRISPR را می توان برای اصلاح سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی استفاده کرد.

کاربرد کریسپر در درمان

محققان به CRISPR به عنوان تکنیکی برای ویرایش نقایص ژنتیکی نگاه می کنند که منجر به بیماری سلول داسی شکل، فیبروز کیستیک، هموفیلی و دیستروفی عضلانی می شود و برای توسعه درمان های هدفمندتر و موثرتر سرطان استفاده می شوند. یک مطالعه نشان داد که موش های بالغ مهندسی شده برای داشتن یک نوع ژنتیکی کوری می توانند با استفاده از ژن درمانی CRISPR درمان شوند (Berry et al. 2019). هدف این است که روزی سلول های بیمار بیماران برداشته شده، با CRISPR “تثبیت” شوند و سپس برای درمان شرایط مختلف به بدن آنها بازگردانده شود یا اندام های بیمار مستقیماً با CRISPR درمان شوند.

کاربرد CRISPR برای ویرایش ژنوم:

• ژنتیک در مقابل اصلاح غیر ژنتیکی / سلول های جنینی
• برنامه ریزی مجدد سلول های سوماتیک
• درمان سرطان
• بیماری ارثی
• بیماری های خونی مانند سلول های بیمار، هموفیلی
•  بیماری عفونی

کاربرد کریسپر در کشاورزی

انتظار می رود فناوری CRISPR توسعه محصولات جدید و بهبود یافته را تسریع کند. این فناوری محصولات و دام هایی را با ویژگی های مطلوبی مانند رشد سریع تر، محتوای مواد مغذی بالاتر و مقاومت در برابر بیماری ها تولید کرده است.

کاربرد کریسپر در صنعت

دانشمندان از سیستم اصلاح شده CRISPR-Cas9 برای ایجاد یک سویه مخمر برای تولید لیپیدها و پلیمرها استفاده کرده اند. این مولکول ها می توانند در توسعه سوخت های زیستی، چسب ها و عطرها مفید باشند. در حال حاضر، این لیپیدها و پلیمرها به صورت مصنوعی از مواد مبتنی بر نفت غیر قابل تجدید ساخته می‌شوند که گران‌تر هستند و می‌توانند خطرات ایمنی را به همراه داشته باشند.

کاربرد کریسپر در سلامت عمومی

دانشمندان در حال آزمایش با استفاده از CRISPR برای مهندسی “gene drives” هستند تا ژن های خاصی را از طریق جمعیتی از آفات حشرات پخش کنند که باعث مرگ یا نابارور شدن آنها می شود. این تکنیک برای از بین بردن پشه‌های حامل عوامل بیماری‌زای انسانی مانند انگل‌های مالاریا یا ویروس زیکا در نظر گرفته می‌شود.